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第一章 核酸的分离与纯化1

第一节 病毒核酸提取1

一、病毒DNA的提取1

二、病毒RNA的提取2

三、技术应用要点3

第二节 细菌核酸的提取4

一、细菌DNA的提取4

二、质粒DNA的提取6

三、细菌RNA的提取7

四、技术应用要点7

第三节 真菌核酸提取8

一、DNA的提取（以酵母菌为例）8

二、RNA的提取（以白色念珠菌为例）9

三、技术应用要点9

第四节 藻类核酸提取9

一、藻类DNA的提取9

二、藻类RNA的提取10

三、技术应用要点11

第五节 原虫核酸提取11

一、疟原虫核酸的提取（含红内期和蚊期）11

二、弓形虫核酸的提取16

三、利什曼原虫核酸的提取20

四、阿米巴核酸的提取22

五、阴道毛滴虫核酸的提取25

六、蓝氏贾第鞭毛虫核酸的提取27

第六节 蠕虫核酸提取29

一、吸虫核酸的提取（以日本血吸虫Schistosoma japonicum为例）29

二、绦虫核酸的提取（以细粒棘球绦虫为例）30

三、线虫核酸的提取（以旋毛虫Trichinella spiralis为例）31

第七节 节肢动物核酸提取33

一、蚊核酸的提取33

二、蝇核酸的提取36

三、蜱核酸的提取38

四、螨核酸的提取38

第二章 目的基因的获取40

第一节 己知部分核酸序列目的基因的获取40

一、已知3端和（或）5端序列目的基因的获取40

二、已知中间序列目的基因的获取44

第二节 未知核酸序列目的基因的获取44

一、已知氨基酸序列的目的基因的获取44

二、根据同源序列获取目的基因48

三、筛选基因文库获取目的基因50

四、抑制性消减杂交技术筛选特异基因52

第三节 多基因的拼接56

一、利用Ⅱs型限制内切酶进行多基因拼接57

二、重叠延伸PCR法进行多基因拼接57

三、利用重叠延伸PCR法进行DNA的人工合成58

四、不依赖连接酶的多基因拼接克隆法60

五、Red/ET同源重组介导的多基因拼接克隆法61

六、技术应用要点62

第三章 基因的扩增及鉴定64

第一节 经典PCR64

一、材料64

二、缓冲液64

三、操作步骤65

四、技术应用要点66

第二节 逆转录PCR （RT-PCR）68

一、材料69

二、操作步骤69

三、技术应用要点70

第三节cDNA末端快速扩增（RACE）71

一、5'-RACE71

二、3'-RACE74

三、技术应用要点76

第四节 靶序列富集多重PCR （Tem PCR）78

一、试剂与仪器78

二、操作步骤78

三、技术应用要点79

第五节 基因组步移79

一、材料80

二、操作步骤80

三、技术应用要点81

第四章 基因的克隆与鉴定84

第一节 载体的制备84

一、质粒的小量提取法——碱裂解法85

二、质粒的小量提取法——快速煮沸裂解法85

三、质粒的大量提取法——碱裂解法86

第二节 目的基因与载体的酶切87

一、酶切位点的设计87

二、载体和目的基因DNA酶切88

三、从凝胶中回收DNA88

第三节 目的基因与载体的连接89

一、黏末端连接（单一酶切）90

二、黏末端连接（双酶切）90

三、平末端连接（T4 DNA酶直接连接法）91

四、平末端连接（同聚物加尾法）93

五、平末端连接（其他方法）94

六、黏-平末端连接95

七、T-A克隆法96

八、PCR产物的非酶连接法快速克隆98

第四节 重组体的转化100

一、感受态细胞的制备——CaC12制备法100

二、重组DNA转化宿主细胞101

第五节 重组子的筛选和鉴定102

一、遗传学表型筛选的方法之一——抗药性筛选102

二、遗传学表型筛选的方法之二——a互补103

三、依赖于重组子结构特征分析的筛选法之一——快速裂解菌落鉴定分子大小104

四、依赖于重组子结构特征分析的筛选法之二——限制性内切酶酶切方法104

五、依赖于重组子结构特征分析的筛选法之三一——PCR法105

六、DNA序列测定105

第五章 基因的表达与分析106

第一节 原核表达106

一、原核表达载体的重要元件106

二、重组蛋白在原核系统中表达的几种类型107

三、感受态细胞的制备108

四、重组载体的构建——目的基因定向克隆109

五、转化与表达112

六、技术应用要点114

第二节 真核表达115

一、宿主细胞的选择116

二、载体的构建116

三、转染与表达117

第三节 无细胞表达129

一、兔网织红细胞裂解表达系统（TNT？ Coupled Reticulocyte Lysate Systems）130

二、大肠杆菌无细胞系统130

三、技术应用要点131

第六章 表达产物的分离、纯化与鉴定133

第一节 样品的制备133

一、样品制备的原则133

二、样品制备流程133

三、重组表达蛋白样品的制备133

四、包涵体蛋白的纯化135

第二节 电泳136

一、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳136

二、常规聚丙烯酰胺凝胶电泳143

三、等电聚焦电泳145

四、技术应用要点151

第三节 透析153

一、材料153

二、方法153

三、透析的其他用途153

第四节 亲和层析154

一、溴化氰活化的琼脂糖亲和层析154

二、谷胱甘肽琼脂糖亲和层析155

三、技术应用要点156

第五节 表达产物鉴定158

一、免疫印迹法158

二、蛋白质一级结构测定（质谱法）164

第七章 蛋白质功能169

第一节 蛋白质功能的理论预测169

一、蛋白质数据库介绍169

二、蛋白质序列分析172

第二节 酶的功能173

一、酶的组织细胞化学技术174

二、同工酶技术180

第三节 蛋白质的细胞及组织定位192

一、免疫荧光技术192

二、免疫酶染色技术（间接法）193

三、免疫胶体金技术（IGS法）194

四、组织免疫金银技术（Histo Gold法）195

五、免疫电镜技术195

第四节 受体蛋白及信号转导蛋白的功能研究196

一、靶标分子作用受体的筛选与鉴定197

二、靶标蛋白作用信号通路的筛选197

三、磷酸化的信号转导分子的鉴定197

四、信号转导中第二信使含量的测定198

五、激酶活性的测定199

六、信号转导蛋白在通路中的功能研究200

第五节 蛋白质相互作用201

一、免疫共沉淀技术201

二、酵母双杂交技术202

三、BIAcore203

第八章 芯片技术207

第一节 基因芯片207

一、基因芯片的工作原理及应用207

二、基因芯片的操作步骤208

三、基因芯片的制备208

四、技术应用要点210

第二节 蛋白芯片211

一、蛋白芯片的工作原理及应用211

二、蛋白芯片的制备211

三、技术应用要点213

第三节 细胞芯片213

一、原理213

二、细胞芯片的分类和应用213

第九章 组学技术215

第一节 基因组学215

一、鸟枪法测序215

二、酵母人工染色体217

三、细菌人工染色体219

第二节 转录组学221

一、表达序列标签221

二、基因表达系统分析223

三、大规模平行信号测序系统227

第三节 蛋白质组学228

一、蛋白质样品的制备228

二、大规模蛋白质分离232

三、质谱分析技术245

四、生物信息学分析248

五、技术应用要点248

第四节 抗体组学250

一、噬菌体抗体库251

二、核糖体展示254

第十章 基因多态性及种群遗传261

第一节SNP261

一、试剂261

二、操作步骤262

三、技术应用要点264

第二节 点突变264

一、聚合酶链反应-单链构象多态性（PCR-SSCP）264

二、变性梯度凝胶电泳（DGGE）267

第三节 微卫星271

一、ISSR-PCR技术271

二、SSR标记275

第四节 片段长度多态性279

一、聚合酶链式反应连接的限制性片段长度多态性279

二、随机扩增多态性DNA （RAPD）技术282

三、扩增片段长度多态性（AFLP）284

四、相关序列扩增多态性（SRAP）287

第五节rDNA及mtDNA291

一、rDNA291

二、mtDNA293

第六节 进化分析295

一、基于DNA序列的系统发育重建的一般步骤及相关软件295

二、序列比对与数据准备297

三、系统发育树的构建与检验300

四、技术应用要点303

第十一章 免疫学技术306

第一节 多克隆抗体的制备306

一、抗原的制备306

二、动物免疫310

三、抗血清的获取及抗体纯化与鉴定311

四、替代技术313

五、技术应用要点313

第二节 单克隆抗体的制备314

一、主要器材与试剂314

二、动物免疫315

三、SP2/0细胞培养315

四、饲养层细胞和融合用小鼠脾细胞的制备315

五、细胞融合和杂交瘤细胞的选择性培养316

六、培养和观察316

七、单克隆抗体的检测与克隆化培养316

八、单克隆抗体的鉴定316

九、单克隆抗体的大量制备317

第三节 体液免疫检测317

一、ELISA317

二、免疫印迹319

三、间接荧光抗体试验（IFAT）321

四、间接血凝试验（IHA322

五、核素示踪技术323

六、技术应用要点324

第四节 细胞免疫检测325

一、免疫细胞的分离325

二、细胞因子的检测327

三、细胞免疫检测其他技术329

四、技术应用要点330

第十二章 疫苗研究332

第一节 减毒活疫苗332

一、疟原虫辐射减毒子孢子制备332

二、血吸虫减毒活疫苗335

第二节 蛋白质及多肽疫苗338

一、材料与试剂338

二、操作步骤338

第三节 核酸疫苗345

一、核酸疫苗的构建346

二、核酸疫苗的制备347

三、弓形虫主要表面抗原单价基因疫苗的构建350

四、核酸疫苗的免疫接种途径354

第四节 细胞疫苗354

一、免疫原制备355

二、抗原的免疫原性分析356

三、免疫小鼠方案356

四、免疫保护效果研究方法356

第五节 佐剂的类型与选择357

一、免疫佐剂的分类357

二、免疫佐剂的作用机制与使用原则357

三、佐剂的类型与选择358

第十三章 诊断技术365

第一节 核酸诊断365

一、Real-time PCR365

二、环介导的核酸恒温扩增法372

三、探针检测374

第二节 免疫学诊断（抗原和抗体检测）375

一、酶联免疫吸附试验376

二、胶体金标记技术378

三、PCR-ELISA技术381

第十四章 转基因技术384

第一节 转基因动物的研究方法384

一、显微注射法385

二、逆转录病毒感染法386

三、胚胎干细胞技术387

四、精子载体技术388

五、胚胎分割与细胞核移植389

第二节 转基因植物的研究方法390

一、常用的植物转化方法390

二、常用的转基因植物检测方法396

第三节 转基因疟原虫404

一、基本原理405

二、操作步骤405

三、技术应用要点407

第四节 转基因弓形虫408

一、外源基因转染弓形虫408

二、转基因弓形虫研究示例409

第五节 转基因蚊410

一、转基因蚊的基本原理410

二、转基因蚊的常用方法411

三、转基因蚊研究的应用前景413

第六节RNAi技术413

一、RNAi穿梭质粒pSIREN-astl的构建413

二、RNAi腺病毒骨架质粒pAd-hTR的构建416

三、RNAi腺病毒的包装、扩增、纯化418

四、对照重组腺病毒Ad-NT siRNA的构建421

五、杜氏利什曼原虫四川人株（H2株）无鞭毛体的培养及感染421

六、荧光定量PCR检测hTRmRNA水平422

七、杜氏利什曼原虫无鞭毛体毒力基因的鉴定423

第十五章 微生物培养技术426

第一节 病毒培养技术426

一、动物接种426

二、鸡胚培养法427

三、组织培养法428

四、病毒培养模式举例431

五、细胞病变观察及病毒量测定432

六、技术应用要点435

第二节 细菌培养技术435

一、普通细菌培养技术436

二、正常菌群及厌氧菌的培养技术441

三、基因工程受体菌的培养446

第三节 真菌培养技术448

一、真菌培养的一般方法448

二、常用真菌培养基449

三、技术应用要点453

第四节 立克次体培养技术453

一、立克次体的一般培养方法454

二、常见病原性立克次体的培养454

三、技术应用要点455

第五节 支原体培养技术455

一、主要试剂配制455

二、支原体基础培养基制备456

三、重要支原体培养基模式举例457

四、支原体培养方法458

五、菌种的纯化与鉴定458

六、支原体菌数测定法459

七、技术应用要点459

第六节 衣原体培养技术460

一、衣原体培养的一般方法460

二、常见病原性衣原体培养461

三、技术应用要点461

第十六章 寄生虫培养技术463

第一节 疟原虫的体外培养463

一、材料及有关试剂配制463

二、培养步骤464

三、疟原虫的克隆466

四、疟原虫的液氮保种467

五、低温冻存疟原虫的复苏467

六、从体外培养的感染血中浓聚恶性疟原虫（Percoll法）468

七、从疟疾患者感染血中去除白细胞（明胶法）469

八、从疟疾患者感染血中浓聚间日疟原虫（Percoll法）469

九、从感染血中分离疟原虫（皂素法）469

第二节 溶组织内阿米巴培养470

一、培养基的配制与操作步骤470

二、技术应用要点471

第三节 锥虫培养472

一、锥虫前鞭毛体的培养472

二、锥虫血液型在小鼠模型中的传代和纯化473

三、锥虫血液型的体外培养474

四、用饲细胞体外培养锥虫血液型475

第四节 血吸虫培养477

一、溶液制备477

二、虫卵培养479

三、毛蚴转化与母胞蚴培养479

四、尾蚴胚胎培养480

五、童虫培养480

六、成虫培养482

第十七章 寄生虫病传播模型的构建技术483

第一节 寄生虫病生态模型的构建483

一、操作步骤483

二、技术应用要点486

第二节 寄生虫病干预模型的构建487

一、蠕虫病化疗干预模型487

二、疫苗接种干预模型488

第三节 模型的验证488

一、验证过程488

二、验证方法488

第四节 常见寄生虫病模型的构建492

一、疟疾流行模型492

二、弓形虫感染模型494

三、黑热病流行模型495

四、血吸虫病流行模型495

五、丝虫病流行模型496

六、包虫病传播模型497

第十八章 生态学研究技术500

第一节 个体生态研究方法500

一、实验室观察500

二、现场观察500

三、技术应用要点501

第二节 种群生态研究方法501

一、种群基本结构特征研究方法501

二、种群空间分布格局研究方法503

三、种群季节消长研究方法505

四、其他研究方法505

五、技术应用要点505

第三节 群落生态研究方法506

一群落基本结构研究方法506

二、种多度分布508

三、群落内总物种数估测508

四、群落内物种之间相互关系的研究方法509

五、群落相似性研究方法510

六、群落数量分类511

七、技术应用要点513

第四节 区系研究方法513

一、现场调查取样514

二、分类鉴定514

三、技术应用要点515

第十九章 监测技术517

第一节 疫情监测517

一、操作步骤517

二、技术应用要点518

第二节 病原体识别与筛查519

一、操作步骤519

二、技术应用要点520

第三节 预警与预测523

一、遥感技术523

二、地理信息系统524

第二十章 预防控制效果评价技术530

第一节 卫生经济评价方法530

一、成本估计531

二、效果估计531

三、成本效果分析531

第二节 标准组群抽样方法533

一、抽样方法533

二、抽样步骤533

三、样本量的计算534

四、技术应用要点534

第三节 质量检验抽样法534

一、操作步骤535

二、技术应用要点536

第四节 捕获-标记-再捕获法537

一、原理537

二、操作步骤537

第五节 德尔菲（Delphi）评价法537

一、方法538

二、操作步骤538

第二十一章 其他技术540

第一节 膜片钳技术540

一、基本原理540

二、膜片钳记录的方式542

三、操作步骤544

四、几种离子通道电流的测定547

五、膜片钳制技术的应用举例552

第二节 共聚焦激光扫描显微技术553

一、结构与原理553

二、图像的三维重建554

三、荧光探针和荧光标记物555

四、双光子（多光子）显微镜559

五、共聚焦激光扫描显微镜检测技术应用举例559

六、共聚焦显微镜检测斯氏狸殖吸虫成虫抗原的定量分析实例560

第三节 组织细胞中一氧化氮的检测561

一、电化学方法561

二、ESR方法562

三、cGMP检测562

四、瓜氨酸含量的测定562

五、NO2-/NO3-含量的测定562

六、形态学方法563

七、血红蛋白测定方法563

八、化学发光法563

九、分子生物学技术564

第四节 细胞凋亡常用的研究方法564

一、形态学观察方法564

二、琼脂糖凝胶电泳法566

三、流式细胞仪分析567

四、原位末端标记法（TUNEL法）568

第五节RNA分析技术569

一、核酶569

二、RNA编辑（RNA editing）572

三、核仁小分子RNA （snoRNA）576

四、小分子RNA （microRNA）578

第六节 虫源性药物的开发技术581

一、虫体内抗菌肽的提取582

二、化学合成法584

三、基因工程法584

第二十二章 动物模型586

第一节 病毒感染动物模型586

一、呼吸道病毒动物模型586

二、轮状病毒动物模型589

三、柯萨奇病毒动物模型589

四、肝炎病毒动物模型590

五、疱疹病毒动物模型591

六、虫媒病毒动物模型592

七、逆转录病毒动物模型595

第二节 细菌动物模型596

一、脑膜炎双球菌新生大鼠模型596

二、肺炎克雷伯菌小鼠模型597

三、幽门螺杆菌动物模型597

四、结核分枝杆菌动物模型597

第三节机会感染性真菌动物模型598

一、肺孢子菌动物模型598

二、白假丝酵母菌动物模型600

三、新生隐球菌动物模型602

第四节 肺炎支原体动物模型603

一、肺炎支原体的培养及菌数测定603

二、动物感染603

三、模型鉴定方法603

第五节 衣原体动物模型604

一、菌株与动物604

二、试剂605

三、操作步骤605

第六节 原虫动物模型606

一、蓝氏贾第鞭毛虫动物模型606

二、杜氏利什曼原虫动物模型607

三、疟原虫动物模型608

第七节 蠕虫动物模型611

一、旋毛形线虫动物模型611

二、马来丝虫动物模型612

三、广州管圆线虫动物模型613

四、日本血吸虫动物模型614

五、血吸虫肝脏肉芽肿动物模型615

六、华支睾吸虫病动物模型616

七、细粒棘球绦虫棘球蚴动物模型617

第八节 医学昆虫的饲养与病原体感染技术618

一、蚊虫饲养及感染618

二、硬蜱的饲养与巴贝虫感染623

三、其他常用的昆虫饲养方法625

第九节 机会感染性原虫动物模型的建立629

一、实验动物的选择及免疫功能不全宿主模型的建立629

二、弓形虫感染动物模型630

三、隐孢子虫感染动物模型631

四、微孢子虫感染动物模型633