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第1章 小鼠的发育遗传学和胚胎学：过去、现在和未来3

1.1 引言5

1.2 孟德尔遗传和连锁：小鼠遗传学的起源5

1.3 实验室用小鼠的起源6

1.4 自交系小鼠的创建和小鼠遗传学的其他资源10

1.5 小鼠发育遗传学的起源12

1.6 实验小鼠胚胎学的继承14

1.7 小鼠基因组的操作16

1.8 系统寻找小鼠中的新基因及发育过程中的突变体17

参考文献19

第2章 小鼠发育概要29

2.1.1 生殖细胞系的起源31

2.1 小鼠的发育31

2.1.2 性别决定和分化39

2.1.3 精子发生39

2.1.4 卵子发生41

2.1.5 排卵44

2.1.6 孤雌发育45

2.1.7 受精46

2.1.8 卵母细胞和合子的细胞骨架组装47

2.1.9 早期卵裂：从1-细胞胚胎到8-细胞未致密化桑葚胚48

2.1.10 用RT-PCR和cDNA文库分析胚胎基因表达50

2.1.11 胚胎细胞核的发育潜能51

2.1.12 致密化和胚泡形成：最早的分化事件52

2.1.14 胚胎植入子宫53

2.1.13 滋养外胚层和内细胞团细胞系的分离53

2.1.15 滋养外胚层及其衍生物55

2.1.16 原始内胚层和外胚层分化：第二轮分化57

2.1.17 小鼠胚胎中的细胞系标记分子57

2.1.18 原始外胚层细胞系57

2.1.19 原肠作用：中胚层和终末内胚层的形成62

2.1.20 原肠作用的命运图谱65

2.1.21 中胚层中区域多样性的产生68

2.1.22 前部脏内胚层68

2.1.23 原结68

2.1.24 尾芽70

2.1.25 胚胎旋转70

2.1.26 体节及其衍生物70

2.1.27 侧板和间介中胚层以及它们的衍生物74

2.1.28 四肢发生76

2.1.29 神经化：神经系统的发生77

2.1.30 神经管区域多样化的发生78

2.1.31 神经嵴79

2.1.32 鳃弓和咽区的发生82

2.1.33 肠的发育83

2.1.34 畸胎瘤细胞和胚胎干细胞83

2.1.35 胚胎大小的调节84

2.1.36 基因印迹85

2.1.37 X染色体失活86

2.1.38 胚外组织87

2.1.39 胚外内胚层：原始内胚层只形成脏内胚层和壁内胚层88

2.1.40 脏内胚层中的基因表达89

2.1.42 胚外中胚层的分化91

2.1.43 胎盘的结构与功能91

2.1.41 壁内胚层中的基因表达91

2.2 成年小鼠93

2.2.1 小鼠毛色及其遗传学93

2.2.2 形态及行为突变98

参考文献98

第3章 转基因小鼠和嵌合体小鼠的生产：一般要点119

3.1 实验鼠群的病原控制121

3.2 提供供体和／或受体小鼠的育种群123

3.3 自然交配的安排123

3.4.1 年龄和体重的影响124

3.4 诱导超数排卵124

3.4.2 促性腺激素的剂量125

3.4.3 促性腺激素的注射时间125

3.4.4 超排小鼠的品系126

3.4.5 种公鼠的繁殖性能126

3.5 胚胎供体和受体的生产126

3.5.1 配种提供DNA注射用合子的母鼠126

3.5.2 提供制作ES细胞嵌合体用囊胚或卵裂期胚胎的母鼠127

3.5.3 繁殖力正常的种公鼠128

3.5.4 用于诱导母鼠假孕的不育公鼠128

3.5.5 用作假孕受体的母鼠129

3.6 基因工程小鼠的命名130

参考文献131

3.7 实验方案［腹腔内（IP）注射］131

第4章 植入前胚胎的收集和体外培养133

4.1 着床前胚胎的培养液135

4.1.1 研究史135

4.1.2 小鼠胚胎的培养液136

4.1.3 胚胎培养液的关键成分137

4.1.4 最新进展139

4.2 体外胚胎培养的一般问题141

4.2.1 培养液的准备141

4.2.2 胚胎收集和培养142

4.2.3 质量控制143

4.3 胚胎培养液的准备144

4.4 移卵管的组装144

4.6.1 方案1 配制M16培养液146

4.5 着床前胚胎的收集146

4.6 实验方案146

4.6.2 方案2 配制M2培养液147

4.6.3 方案3 从浓储液制备M2和M16培养液148

4.6.4 方案4 制备KSOM培养液149

4.6.5 方案5 制备培养微滴150

4.6.6 方案6 用玻璃毛细管拉制移卵管151

4.6.7 方案7 玻璃移液管的硅化152

4.6.8 方案8 打开腹腔并定位雌性生殖器官153

4.6.9 方案9 收集合子并利用透明质酸酶去掉卵丘细胞153

4.6.10 方案10 收集2-细胞到致密化的桑葚胚阶段的胚胎156

4.6.11 方案11 囊胚的收集159

参考文献160

第5章 植入后胚胎的分离、培养和操纵167

5.1 植入后胚胎的分离169

5.1.1 早期胚胎着床点的观察169

5.1.2 植入后胚胎的分离169

5.1.3 胚外膜的剥离169

5.1.4 植入后胚胎胚层的分离170

5.1.5 胚层的重组和培养170

5.1.6 从生殖嵴中分离生殖细胞170

5.2 植入后胚胎的培养171

5.2.1 胚胎的准备171

5.2.2 植入后胚胎的滚筒式培养171

5.2.3 植入后胚胎的静态式培养171

5.3 植入后胚胎基因注射的电穿孔技术172

5.2.4 用于摄取图像的植入后胚胎的静态式培养172

5.4 实验方案173

5.4.1 方案1 通过注射染料观察早期胚胎的着床点173

5.4.2 方案2 植入后胚胎的分离174

5.4.3 方案3 胚外膜的剥离177

5.4.4 方案4 植入后胚胎胚层的分离181

5.4.5 方案5 胚层的重组与培养183

5.4.6 方案6 自生殖嵴中分离生殖细胞184

5.4.7 方案7 植入后胚胎的旋转式培养186

5.4.8 方案8 植入后胚胎的静态式培养190

5.4.9 方案9 用于摄取图像的植入后胚胎的静态式培养191

5.4.10 方案10 电穿孔技术193

参考文献195

第6章 外科手术方法197

6.1 概论199

6.2 输精管及卵巢切除术200

6.3 胚胎移植200

6.3.1 输卵管内胚胎移植200

6.3.2 子宫内胚胎移植200

6.3.3 受体雌鼠201

6.3.4 胚胎移植的技术要点201

6.4 剖腹产手术和子鼠寄养202

6.5 组织移植202

6.6 活体组织检查202

6.7 实验方案202

6.7.1 方案1 制作不育雄鼠的输精管切除术202

6.7.2 方案2 诱导胚泡延迟着床的卵巢摘除术205

6.7.3 方案3 输卵管内胚胎移植206

6.7.4 方案4 子宫内胚胎移植209

6.7.5 方案5 剖腹产手术和子鼠寄养211

6.7.6 方案6 肾囊下组织移植212

6.7.7 方案7 ES细胞的皮下注射214

6.7.8 方案8 肝脏的部分切除术214

6.7.9 方案9 脾切除术215

6.7.10 方案10 肾切除术216

6.7.11 方案11 去势术216

6.7.12 方案12 尾动脉采血217

参考文献218

第7章 转基因小鼠的制备221

7.1 小鼠转基因技术的应用223

7.2 原核显微注射法将基因导入小鼠基因组224

7.3.1 原核载体序列的影响225

7.3 转基因的构建225

7.3.2 DNA构件的长度226

7.3.3 两种或多种转基因的共注射226

7.3.4 转基因与内源基因的差异性表达226

7.3.5 调控序列的鉴定方法227

7.3.6 报告基因227

7.3.7 转基因构件中已知组织特异性调控序列的利用227

7.3.8 转基因表达过程中cDNA的表达以及内含子的作用228

7.3.9 利用“管家基因”启动子指导基因的专一性表达228

7.3.10 影响基因转移效率的相关因素228

7.4 DNA的分离与纯化229

7.4.1 概述229

7.3.11 大型DNA构件相关知识概述229

7.4.2 DNA污染物及其去除方法230

7.4.3 推荐使用的商业化质粒制备及DNA纯化试剂盒231

7.4.4 从细菌培养物中提取标准大小的质粒DNA231

7.4.5 质粒DNA消化获得基因构件片段232

7.4.6 凝胶分离232

7.4.7 琼脂糖凝胶中DNA片段的回收233

7.4.8 DNA片段的纯化233

7.5 显微注射用DNA的制备233

7.5.1 DNA质量的鉴定及其维持233

7.5.2 注射用DNA浓度的测定234

7.6.3 固定针的制作235

7.6.2 合子的准备235

7.6.1 小鼠品系的选择235

7.6 操作器械以及合子的准备235

7.5.4 DNA的储存235

7.5.3 DNA溶液需要过滤吗235

7.6.4 显微注射针的制作236

7.6.5 显微操作设备的安装238

7.7 显微注射241

7.7.1 原核注射的时间241

7.7.2 小鼠合子的显微注射241

7.7.3 注射后的胚胎操作241

7.8 转基因小鼠品系的建立及其维持242

7.9 实验方案242

7.9.1 方案1 简便可靠的DNA分离与纯化方法242

7.9.3 方案3 NucleoBond制备的BAC DNA的纯化244

7.9.2 方案2 利用NucleoBond系统从细菌培养物中分离BAC DNA244

7.9.4 方案4 酵母DNA凝胶板的大规模制备245

7.9.5 方案5 利用过滤法纯化YAC DNA247

7.9.6 方案6 标准大小DNA的注射缓冲液的配制248

7.9.7 方案7 BAC/YAC DNA注射缓冲液的配制249

7.9.8 方案8 固定针的制作249

7.9.9 方案9 注射针的制作250

7.9.10 方案10 显微操作步骤251

7.9.11 方案11 小鼠合子的显微注射253

7.10 常见问题排除指南256

参考文献260

第8章 囊胚来源的干细胞系的分离和培养269

8.1 ES细胞系的获得271

8.2.1 支原体和小鼠抗体产物的检测272

8.2 ES细胞的培养272

8.2.2 ES细胞的培养条件273

8.2.3 培养基274

8.2.4 血清275

8.2.5 白血病抑制因子276

8.2.6 胰蛋白酶／EDTA276

8.3 饲养细胞276

8.3.1 原代小鼠胚胎成纤维细胞276

8.3.2 STO成纤维细胞277

8.4 ES细胞染色体的计数277

8.7.1 方案1 小鼠胚胎成纤维细胞的制备278

8.7 实验方案278

8.6 滋胚层干细胞278

8.5 ES细胞在体外的分化278

8.7.2 方案2 由MEF或STO细胞制备饲养层细胞280

8.7.3 方案3 ES细胞的传代281

8.7.4 方案4 用冻存管冷冻和解冻ES细胞282

8.7.5 方案5 用囊胚从头分离ES细胞283

8.7.6 方案6 ES细胞染色体的计数288

8.7.7 方案7 ES细胞分化为类胚体290

8.7.8 方案8 培养TS细胞系290

8.7.9 方案9 从囊胚分离TS细胞系292

参考文献294

第9章 基于胚胎干细胞的转基因和基因组改变的载体设计297

9.1.2 可筛选标记299

9.1.1 基因组和基因元件299

9.1 元件总汇299

9.1.3 报告基因301

9.1.4 位点特异重组酶301

9.1.5 可诱导系统303

9.1.6 检测重组酶的报告子303

9.2 ES细胞介导的转基因303

9.3 基因打靶305

9.4 基因和启动子诱捕308

9.5 同源重组——置换310

9.6 位点特异性重组介导的插入311

9.7 可诱导位点特异染色体变异313

9.8 产生纯合突变的ES细胞系314

9.9 实验方案（体外筛选以在小鼠中获得普遍性转基因表达）315

参考文献317

第10章 向胚胎干细胞中导入外源DNA323

10.1 一般注意事项325

10.2 向ES细胞基因组中导入的DNA的纯化325

10.3 DNA导入ES细胞的电转化以及筛选方法325

10.4 ES细胞克隆的挑取、平板传代以及冻存ES细胞系用于基因型分析325

10.5 用培养于96孔组织培养板中的细胞快速准备DNA326

10.6 实验方案327

10.6.1 方案1 通过电转化向ES细胞中导入DNA以及筛选方法327

10.6.2 方案2 通过挑取的方法分离单个ES细胞克隆329

10.6.3 方案3 在96孔组织培养板中冻存ES细胞330

10.6.4 方案4 在96孔组织培养板中解冻ES细胞331

10.6.5 方案5 用培养于96孔组织培养板中的细胞快速准备DNA332

10.6.6 方案6 用培养于24孔组织培养板中的细胞准备DNA333

10.6.7 方案7 挑取克隆前对ES细胞克隆进行基因型分析334

参考文献336

第11章 嵌合体的制作337

11.1 总论339

11.2 嵌合体的类型341

11.2.1 二倍体胚胎-二倍体胚胎聚集的嵌合体341

11.2.2 ES细胞-二倍体胚胎聚集和注射的嵌合体342

11.2.3 二倍体胚胎-四倍体胚胎聚集的嵌合体342

11.2.4 ES细胞-四倍体胚胎凝集和注射的嵌合体343

11.3 ES细胞注射嵌合体的产生344

11.3.1 注射用囊胚的准备344

11.3.3 注射针和固定针的制备345

11.3.2 注射用ES细胞的准备345

11.3.4 ES细胞注射针针尖的制备346

11.3.5 显微注射仪的组装346

11.4 聚集嵌合体的制作347

11.5 嵌合囊胚的移植347

11.6 用ES细胞注射或聚集法所产生的嵌合小鼠的饲养347

11.7 实验方案348

11.7.1 方案1 注射用ES细胞的制备348

11.7.2 方案2 Sutter拉针仪P-97型有用参数的确定349

11.7.3 方案3 ES细胞注射针尖的折断350

11.7.4 方案4 显微注射仪的组装351

11.7.5 方案5 囊胚注射352

11.7.6 方案6 制备凝集用的ES细胞355

11.7.7 方案7 制备凝集板356

11.7.8 方案8 去透明带357

11.7.9 方案9 四倍体胚胎的产生358

11.7.10 二倍体胚胎之间的聚集360

11.7.11 方案11 把卵裂期的胚胎和囊胚期的内细胞团细胞分散成单个细胞364

11.7.12 方案12 免疫外科手术分离囊胚的内细胞团365

参考文献368

第12章 小鼠基因组变化及其特定序列的检测和分析371

12.1 动物的标记373

12.2 用于检测基因型或转基因特征的组织样品和DNA制备374

12.3 检测和分析原核注射产生的转基因375

12.4 检测和分析ES细胞介导的基因／基因组改变376

12.5 小鼠染色体和核型377

12.6 转基因表达分析377

12.8 鉴别纯合转基因小鼠或胚胎379

12.7 克隆转基因-宿主DNA连接379

12.8.1 量化转基因剂量380

12.8.2 量化转基因产物或表型380

12.8.3 间期核的原位杂交380

12.8.4 后代检测380

12.8.5 用搭界探针进行Southern印迹分析381

12.8.6 用搭界引物进行PCR分析381

12.9 实验方案381

12.9.1 方案1 从小鼠尾尖中提取高分子量DNA381

12.9.2 方案2 从胚胎组织、卵黄囊和脐带等提取高分子量DNA382

12.9.3 方案3 用于制备PCR模板的组织裂解383

12.9.4 方案4 聚合酶链式反应386

12.9.5 方案5 从ES细胞或其他培养细胞中制备Southern杂交用或PCR用DNA387

12.9.6 方案6 小鼠细胞核型分析388

参考文献390

第13章 小鼠孤雌生殖、原核移植和克隆393

13.1 孤雌胚的制作395

13.2 原核移植395

13.3 小鼠克隆395

13.4 实验方案396

13.4.1 方案1 乙醇诱导的卵母细胞孤雌激活396

13.4.2 方案2 小鼠胚胎的原核移植396

13.4.3 方案3 小鼠克隆402

参考文献409

第14章 辅助生殖——卵巢移植、体外受精、人工授精和胞质内精子注射411

14.1.1 雌性不育413

14.1 不育413

14.1.2 雄性不育414

14.2 挽救小鼠生殖功能的策略414

14.2.1 卵巢移植414

14.2.2 体外受精415

14.2.3 人工授精418

14.2.4 胞质内精子注射418

14.3 实验方案419

14.3.1 方案1 卵巢移植419

14.3.2 方案2 体外受精420

14.3.3 方案3 非手术法人工授精422

14.3.4 方案4 手术法人工授精424

14.3.5 方案5 胞质内单精子注射425

参考文献432

第15章 小鼠胚胎的冷冻、解冻及运输435

15.1 胚胎冷冻437

15.1.1 平衡冷冻法437

15.1.2 非平衡冷冻法437

15.1.3 胚胎冷冻中应考虑的因素438

15.2 精子冷冻保存438

15.3 卵巢冷冻保存439

15.4 储藏和记录439

15.5 小鼠品系的恢复440

15.6 小鼠胚胎的运输441

15.7 实验方案441

15.7.1 方案1 胚胎慢速冷冻法441

15.7.2 方案2 胚胎快速冷冻法443

15.7.3 方案3 精子冷冻447

15.7.4 方案4 卵巢冷冻449

15.7.5 方案5 胎的包装和运输450

参考文献451

第16章 基因表达产物、细胞、组织及器官系统的观察技术457

16.1 基因表达产物的观察459

16.1.1 提取鼠胚胎或胎儿组织中的总RNA459

16.1.2 电泳分析嵌合组织中的磷酸葡萄糖异构酶同工酶459

16.1.3 普通免疫组化和原位杂交技术用于分析鼠胚胎部分组织459

16.1.4 胚胎切片免疫组化460

16.1.5 全胚免疫组化460

16.1.6 胚胎和组织切片的RNA探针原位杂交460

16.1.7 全胚的RNA探针原位杂交461

16.1.8 β-半乳糖苷酶活性染色462

16.2 细胞观察（荧光蛋白观察）463

16.1.9 碱性磷酸酶活性染色463

16.3.1 组化染色观察小鼠骨骼465

16.3.2 印度黑染色液注射观察胎儿血管系统465

16.3 组织和器官系统的观察465

16.3.3 塑形术观察胎儿大血管467

16.4 实验方案467

16.4.1 方案1 提取小鼠胚胎或胎儿组织中的总RNA467

16.4.2 方案2 电泳分析嵌合组织中的磷酸葡萄糖异构酶同工酶469

16.4.3 方案3 组织固定液的准备471

16.4.4 方案4 处理囊胚用于固定472

16.4.5 方案5 石蜡包埋472

16.4.6 方案6　切片474

16.4.7 方案7 准备载玻片和盖玻片用于原位杂交475

16.4.9 方案9 胚胎切片免疫组化477

16.4.8 方案8 切片去石蜡和再水化用于原位杂交或染色477

16.4.10 方案10 全胚免疫组化479

16.4.11 方案11 胚胎和组织切片的RNA探针原位杂交482

16.4.12 方案12 全胚RNA探针原位杂交487

16.4.13 方案13 全胚原位杂交后胚胎成像491

16.4.14 方案14 全胚原位杂交后胚胎切片491

16.4.15 方案15 β-半乳糖苷酶（lacZ）活性染色493

16.4.16 方案16 碱性磷酸酶活性染色496

16.4.17 方案17 着床后全胚绿色荧光蛋白（GFP）表达的观察496

16.4.18 方案18 活细胞GFP融合蛋白观察497

16.4.19 方案19 固定细胞内GFP的观察497

16.4.20 方案20 固定和石蜡包埋用于GFP观察498

16.4.22 方案22 Alcian蓝／茜素红（alizarine）染软骨和骨组织499

16.4.21 方案21 Alcian蓝染胎儿软骨组织499

16.4.23 方案23 出生后胎儿骨组织的茜素红染色500

16.4.24 方案24 注射印度黑染液观察胎儿血管系统501

16.4.25 方案25 塑形术（plasticcasting）观察胎儿大血管502

参考文献502

第17章 显微操作实验室的建立505

17.1 小鼠、饲养管理和标记系统507

17.1.1 近交系、远交系、杂交系和遗传修饰小鼠507

17.1.2 笼具、饲养管理和标记507

17.2 显微操作实验室及其环境508

17.2.1 总则508

17.2.2 显微注射实验室的常用仪器508

17.2.3 体视显微镜及其有关设备510

17.2.4 显微操作设备512

17.2.5 电融合和聚合513

17.2.6 用玻璃毛细管制作显微操作工具513

17.2.7 精细仪器和工具514

17.2.8 耗材和塑料器皿515

17.2.9 冷冻保存515

17.3 信息资源515

17.4 声明517

附录1 缓冲液和溶液519

参考文献526

附录2 注意事项527

附录3 供应商536

索引537