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第一篇 植物基因工程的目的基因1

第1章 抗植物虫害基因及其应用3

1.1 bt基因及其应用4

1.2 蛋白酶抑制剂基因及其应用9

1.3 植物凝集素基因及其应用12

1.4 淀粉酶抑制剂基因及其应用13

1.5 胆固醇氧化酶基因14

1.6 营养杀虫蛋白基因14

1.7 系统肽基因14

1.8 其他抗虫基因15

1.9 非蛋白质类杀虫剂调控基因16

1.10 抗虫基因的互补和协同作用16

第2章 抗植物病毒基因及其应用21

2.1 cp基因及其应用21

2.2 病毒复制酶基因及其应用23

2.3 病毒卫星RNA的利用24

2.4 反义RNA介导抗病毒25

2.5 缺陷型运动蛋白介导的抗病毒25

2.6 植物体内的抗病毒基因26

2.7 缺陷干扰颗粒抗病毒27

2.8 核糖体失活蛋白基因及其应用27

2.9 干扰素基因及其应用29

第3章 抗植物真菌病害基因及其应用31

3.1 几丁质酶基因与β-1，3-葡聚糖酶基因及其应用32

3.2 植物抗毒素基因及其应用34

3.3 来自植物的抗真菌基因及其应用35

3.4 rip基因及其抗真菌病的应用36

3.5 过氧化物酶基因及其应用38

3.6 SAR的抗病基因38

第4章 抗植物细菌病害基因及其应用43

4.1 病原菌自身的抗性基因及其应用43

4.2 抗菌肽基因及其应用44

4.3 溶菌酶基因及其应用46

4.4 病原相关蛋白基因及其应用47

4.5 防御素基因及其应用48

4.6 植物保卫素及其合成酶基因49

4.7 TLP蛋白基因及其应用50

4.8 水稻xa21基因及其应用51

4.9 拟南芥rps2基因及rpml基因的结构功能52

第5章 抗非生物胁迫基因及应用55

5.1 耐除草剂基因及其应用55

5.2 抗其他非生物胁迫的基因及其应用61

第6章 提高作物产量、改良作物品质的基因及其应用74

6.1 提高作物产量的基因及其应用74

6.2 改良作物品质的基因及其应用77

第7章 改良植物其他形状和雄性不育的基因及其应用89

7.1 调控胚胎发生、形态建成的基因及其应用89

7.2 植物激素基因对植物生长发育的调控及其应用92

7.3 调控植物花色、花形、衰老的基因及其应用95

7.4 植物雄性不育基因及其应用98

第8章 植物医药基因工程及其应用106

8.1 植物医药基因工程概述106

8.2 植物医药基因工程的表达系统108

8.3 植物医药基因工程的研究进展及应用112

第二篇 目的基因的分离克隆123

第9章 基因芯片技术分离目的基因125

9.1 生物芯片概述125

9.2 利用基因芯片技术分离目的原因128

9.3 基因芯片技术在植物基因工程研究中的其他应用138

9.4 基因芯片技术的评价及发展前景140

第10章 基因文库技术分离目的基因143

10.1 基因文库的类别144

10.2 植物核基因组文库构建147

10.3 植物cDNA文库构建150

10.4 利用PCR技术构建植物cDNA文库154

10.5 减法cDNA文库的PCR法构建157

10.6 人工染色体文库159

10.7 基因文库筛选方法168

10.8 问题与展望170

第11章 功能蛋白组技术分离目的基因173

11.1 功能蛋白组技术概述173

11.2 蛋白质双向电泳技术174

11.3 功能蛋白氨基酸序列分析178

11.4 功能蛋白基因分离182

第12章 PCR技术在植物基因克隆中的应用188

12.1 PCR基本技术189

12.2 RT-PCR194

12.3 cDNA末端的快速克隆(RACE技术)197

12.4 基因组DNA相邻片段的体外克隆202

12.5 突变基因及重组基因的PCR法构建204

12.6 PCR技术在植物基因克隆中的其他应用206

第13章 mRNA差别显示技术分离差别表达基因207

13.1 mRNA差别显示技术的基本原理208

13.2 mRNA差别显示技术分离差别表达基因的基本程序208

13.3 mRNA差别显示技术的优点及局限性208

13.4 mRNA差别显示技术的改进210

13.5 mRNA差别显示实验中的注意事项214

第14章 插入突变分离克隆目的基因217

14.1 插入失活筛选重组体217

14.2 插入接头突变分离克隆目的基因219

14.3 T-DNA标签法分离克隆目的基因220

14.4 转座子诱变分离克隆目的基因222

14.5 插入突变的其他应用230

第15章 图位克隆的目的基因232

15.1 图位克隆的基本原因232

15.2 图位克隆的基本程序233

15.3 图位克隆的主要技术环节233

15.4 图位克隆植物目的基因的进展和展望239

第16章 酵母双杂交系统分离克隆目的基因242

16.1 酵母双杂交系统的基本原理242

16.2 酵母双杂交系统的内容244

16.3 基本操作程序246

16.4 酵母双杂交系统的特点分析246

16.5 酵母双杂交系统的应用和发展249

第17章 生物信息学技术在分离克隆基因中的应用253

17.1 生物信息学技术概述253

17.2 用生物信息学技术发现和分离目的基因的方法及原理259

17.3 用生物信息学技术分离目的基因的优点及不足263

17.4 生物信息学的发展和展望264

第18章 基因分离克隆的新技术及其选择策略267

18.1 基因分离克隆的新技术268

18.2 目的基因分离克隆方法的评述与选择策略284

第三篇 目的基因的转化293

第19章 植物基因工程载体及其构建295

19.1 植物基因工程载体种类及命名规则296

19.2 根癌农杆菌Ti质粒的结构与功能297

19.3 农杆菌Ti质粒基因转化机理308

19.4 农杆菌Ti质粒的改造及载体构建316

19.5 载体构建中常用的选择标记基因及报告基因330

19.6 常用的植物基因工程载体337

第20章 植物基因转化受体系统的建立344

20.1 植物基因转化受体系统的条件344

20.2 植物基因转化受体系统的类型及其特性347

20.3 植物基因转化受体系统建立的程序350

20.4 植物基因转化受体系统建立中常遇的问题355

第21章 根癌农杆菌Ti质粒介导基因转化360

21.1 根癌农杆菌的生物学特性362

21.2 根癌农杆菌侵染植物细胞的化学机理364

21.3 根癌农杆菌的侵染能力及其特异性372

21.4 根癌农杆菌的转化策略377

21.5 根癌农杆菌转化程序及操作原理385

21.6 根癌农杆菌Ti质粒转化的方法397

21.7 根癌农杆菌转化系统的评述401

第22章 发根农杆菌Ri质粒载体基因转化407

22.1 发根农杆菌的生物学特性408

22.2 Ri质粒的基因结构与功能411

22.3 发根农杆菌基因转化策略417

22.4 发根农杆菌基因转化的方法及操作418

22.5 Ri质粒基因转化的影响因素420

22.6 Ri质粒T-DNA在转化体中的遗传特性421

22.7 发根农杆菌转化的应用422

第23章 植物病毒载体介导基因转化426

23.1 植物病毒的生物学特性427

23.2 双链DNA病毒转化载体431

23.3 植物单链DNA病毒转化载体440

23.4 植物单链RNA病毒的基因转化载体444

23.5 反转录病毒基因转化载体446

23.6 植物病毒作为基因转化载体的应用潜力和策略450

第24章 DNA直接导入基因转化及原理455

24.1 化学诱导DNA直接转化456

24.2 物理法诱导DNA直接转化461

第25章 种质系统介导基因转化481

25.1 花粉管通道法介导基因转化482

25.2 生殖细胞浸泡法介导基因转化491

25.3 胚囊、子房注射法介导基因转化494

第26章 植物基因转化系统的选择策略及单子叶植物基因转化497

26.1 植物基因转化系统的分析497

26.2 植物基因转化系统的选择原则500

26.3 单子叶植物的基因转化501

第四篇 转基因植物的检测与鉴定515

第27章 报告基因的表达检测517

27.1 gfp(绿色荧光蛋白)基因的检测517

27.2 gus(β-葡萄糖苷酸酶)基因的检测518

27.3 cat(氯霉素乙酰转移酶)基因的检测523

27.4 冠瘿碱合成酶基因的检测525

27.5 萤光素酶基因的检测527

27.6 npt-Ⅱ基因的检测527

27.7 pat基因的检测529

27.8 二氢叶酸还原酶基因的检测530

第28章 外源基因整合的Southern杂交鉴定532

28.1 分子杂交概述532

28.2 Southern杂交533

第29章 外源基因转录的Northern杂交鉴定578

29.1 植物RNA提取578

29.2 探针制备582

29.3 Northern斑点杂交582

29.4 Northern印迹杂交583

第30章 外源基因表达蛋白的检测586

30.1 ELISA检测586

30.2 Western杂交591

30.3 表达蛋白的含量测定595

第31章 外源基因整合及表达的原位杂交检测598

31.1 染色体DNA原位杂交599

31.2 组织细胞mRNA原位杂交600

31.3 外源基因表达蛋白的组织细胞免疫定位602

31.4 组织印迹的Northern及Western杂交604

第32章 转基因植物的PCR检测606

32.1 外源基因整合的PCR-Southern杂交检测606

32.2 外源基因拷贝数的IPCR检测614

32.3 外源基因表达的RT-PCR检测615

第33章 外源基因整合及表达的其他分析方法617

33.1 外源基因整合的RFLP分析原理617

33.2 外源基因整合的RAPD分析原理618

33.3 外源基因整合位点的遗传学分析618

33.4 生物芯片技术在转基因植物检测中的应用619

第五篇 转基因植物的遗传特性及表达调控621

第34章 转基因植物中外源DNA的整合特性623

34.1 外源DNA的整合位点和拷贝数623

34.2 外源DNA结构对整合的影响626

34.3 转化后整合位点的DNA结构变化628

34.4 转化方法对整合外源基因结构的影响628

34.5 位点特异性重组631

第35章 转基因植物中外源DNA整合的遗传效应638

35.1 位置效应638

35.2 重组效应639

35.3 转基因沉默640

35.4 克服转基因沉默的策略647

第36章 转基因植物中外源基因的遗传特性650

36.1 外源基因在转化植物中的遗传传递规律650

36.2 转基因的遗传稳定性654

36.3 外界环境对转基因遗传特性的影响658

36.4 不同转化方法获得的转基因植株的遗传特性比较659

第37章 转化外源基因的瞬时表达和稳定表达662

37.1 高等植物基因表达系统特点662

37.2 转化外源基因的瞬时表达666

37.3 转化外源基因的稳定表达668

37.4 外源基因的同源性和异源性表达674

第38章 转化外源基因的表达调控677

38.1 启动子对转化外源基因转录的调控作用677

38.2 终止子对转化外源基因的转录调控作用678

38.3 5'端及3'端序列对转化外源基因转录后的调控作用679

38.4 内含子对转化外源基因的表达调控作用681

38.5 信号肽序列对转化外源基因翻译产物的调控作用682

38.6 DNA甲基化对转化外源基因表达的调控作用684

38.7 激素对转化外源基因表达的调控作用685

38.8 提高转化外源基因表达水平的策略690

第39章 植物基因工程研究进展、存在的问题及新策略698

39.1 植物基因工程研究进程698

39.2 植物基因工程存在的问题708

39.3 植物基因工程的新策略713

39.4 展望727

第六篇 植物基因工程实验技术731

第一部分 目的基因克隆及载体构建733

实验1-1 大肠杆菌质粒DNA提取734

实验1-2 大肠杆菌质粒DNA纯化736

实验1-3 农杆菌Ti质粒DNA提取738

实验1-4 农杆菌双元载体中mini-Ti质粒提取739

实验1-5 M13噬菌体DNA提取740

实验1-6 植物总DNA提取742

实验1-7 植物核DNA提取744

实验1-8 植物细胞器DNA提取747

实验1-9 植物总RNA提 取750

实验1-10 总RNA中mRNA的分离752

实验1-11 cDNA合成754

实验1-12 核酸提取物纯度及浓度检测755

实验1-13 目的基因的PCR扩增757

实验1-14 mRNA差别显示(DDRT-PCR)758

实验1-15 目的基因与载体的限制酶酶切及连接761

实验1-16 重组质粒DNA转化大肠杆菌766

实验1-17 重组质粒DNA的检测767

实验1-18 DNA序列测定768

实验1-19 中间表达载体构建774

实验1-20 中间载体直接导入农杆菌776

实验1-21 三亲交配法将中间载体导入农杆菌777

实验1-22 菌落原位杂交778

实验1-23 cDNA文库构建780

实验1-24 YAC文库构建782

实验1-25 BAC文库构建787

实验1-26 TAC文库构建788

实验1-27 酵母双杂交系统分离克隆目的基因790

第二部分 目的基因的转化792

实验2-1 根癌农杆菌整体植株及离体器官接种诱发冠瘿瘤792

实验2-2 冠瘿瘤的离体培养及植株再生794

实验2-3 农杆菌叶盘法转化795

实验2-4 悬浮细胞与农杆菌共培养转化798

实验2-5 原生质体与农杆菌共培养转化799

实验2-6 发根农杆菌整体植株接种及离体器官共培养诱导毛状根800

实验2-7 毛状根的离体培养及植株再生801

实验2-8 发根农杆菌介导的目的基因转化802

实验2-9 病毒介导外源基因转化803

实验2-10 基因枪转化外源基因805

实验2-11 PEG介导基因转化807

实验2-12 电激诱导基因转化808

实验2-13 显微注射导入外源基因809

实验2-14 激光转化外源基因811

实验2-15 超声波转化外源基因812

实验2-16 脂质体转化外源基因814

实验2-17 花粉粒媒体介导外源基因转化817

实验2-18 子房注射导入外源基因819

实验2-19 穗鞘腔浸泡导入外源基因820

实验2-20 种子浸泡导入外源基因820

第三部分 转基因植物的检测技术822

实验3-1 冠瘿碱检测823

实验3-2 NPT-Ⅱ活性检测826

实验3-3 Gus活性检测831

实验3-4 Cat活性检测836

实验3-5 Pat活性检测839

实验3-6 Dhfr活性检测840

实验3-7 萤光素酶活性检测841

实验3-8 转基因植物总核酸的提取843

实验3-9 转基因植物的Southern印迹杂交鉴定844

实验3-10 外源基因整合的PCR-Southern印迹杂交检测854

实验3-11 外源基因表达的Northern印迹杂交检测854

实验3-12 外源基因表达的RT-PCR检测856

实验3-13 外源基因整合的原位杂交857

实验3-14 外源基因表达的mRNA原位杂交859

实验3-15 外源基因表达的ELISA检测861

实验3-16 外源基因表达的Western印迹分析863

实验3-17 外源基因表达的组织印迹法检测866

实验3-18 用cDNA芯片检测拟南芥基因表达867

实验3-19 利用生物信息学技术推断基因未知序列869

实验3-20 cDNA芯片制备及杂交870

附录874

附录1 常用的测量单位及换算874

附录2 常用的分子质量标准物875

附录3 凝胶电泳中凝胶浓度的分离范围877

附录4 常用的限制酶的主要性质及缓冲液877

附录5 常用抗生素配制及使用浓度878

附录6 主要溶液（母液）及缓冲液配制879

附录7 常用的农杆菌培养基成分（g/L）881

附录8 SephadexG-50柱层析纯化DNA881

附录9 重要植物种的核基因组大小882

附录10 不同物种对密码子使用的偏向性比较883

附录11 部分重要的生物信息学网络资源887