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第1章 分子药理学实验方法1

1.1 核酸技术3

1.1.1 质粒操作3

1.1.2 PCR技术6

1.1.3 重组DNA技术14

1.1.4 基因转染技术18

1.1.5 核酸杂交23

1.1.6 基因芯片技术33

1.1.7 反义核酸技术38

1.1.8 RNA干扰42

1.2 蛋白质技术45

1.2.1 常规蛋白质定量方法45

1.2.2 酶联免疫吸附测定47

1.2.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳51

1.2.4 Western印迹法57

1.2.5 免疫共沉淀59

1.2.6 酵母双杂交62

1.2.7 膜片钳技术67

1.2.8 放射配体受体结合实验73

1.3 细胞培养和形态、功能检测80

1.3.1 常规细胞培养80

1.3.2 原代大鼠细胞分离和培养85

1.3.3 细胞凋亡检测方法91

1.3.4 流式细胞分析96

1.3.5 免疫组织化学染色100

1.3.6 酶联免疫斑点法104

1.3.7 单细胞微凝胶电泳107

参考文献108

第2章 新药主要药效学试验方法112

2.1 中枢神经系统药物114

2.1.1 麻醉药物114

2.1.2 镇静催眠药123

2.1.3 抗癫痫、抗惊厥药物129

2.1.4 抗帕金森病药物145

2.1.5 抗老年性痴呆药物149

2.1.6 抗精神分裂症药物156

2.1.7 抗焦虑药实验方法161

2.1.8 抗抑郁药物178

2.1.9 镇痛药物192

2.1.10 中枢兴奋药物197

2.1.11 阿片戒断反应治疗药物199

2.2 心血管系统药物202

2.2.1 抗心律失常药物202

2.2.2 抗高血压药物207

2.2.3 抗心肌缺血药物211

2.2.4 溶栓药物218

2.2.5 抗凝血药物224

2.2.6 抗血小板药物227

2.2.7 调血脂药物和抗动脉粥样硬化药物234

2.2.8 防治脑缺血损伤药物237

2.3 抗肿瘤药物242

2.3.1 体外抗肿瘤试验242

2.3.2 常规体内抗肿瘤药物试验245

2.3.3 生物反应调节剂的试验方法247

2.3.4 原位移植模型抗肿瘤试验247

2.3.5 抗肿瘤转移试验249

2.3.6 抗肿瘤血管新生药物试验254

2.4 抗细菌、真菌、病毒和寄生虫药物257

2.4.1 抗细菌药物257

2.4.2 抗真菌药物271

2.4.3 抗乙型肝炎病毒药物278

2.4.4 抗人类免疫缺陷病毒药物281

2.4.5 抗疟药物286

2.5 抗骨和关节病药物291

2.5.1 治疗骨质疏松症药物291

2.5.2 促进骨折愈合药物293

2.5.3 抗关节炎药物295

2.6 抗糖尿病药物299

2.6.1 糖耐量试验300

2.6.2 化学诱导剂致动物糖尿病模型300

2.6.3 遗传性糖尿病动物模型试验303

2.6.4 α-葡糖苷酶活性测定305

2.7 消化系统药物306

2.7.1 抗消化性溃疡药物306

2.7.2 抗胃炎药物309

2.7.3 胃肠解痉药物311

2.7.4 催吐药及止吐药313

2.7.5 泻药及止泻药315

2.7.6 抗急性肝损伤药物316

2.7.7 抗肝纤维化药物318

2.8 血液系统药物321

2.8.1 防治贫血药物321

2.8.2 治疗白细胞减少和粒细胞缺乏症药物323

2.8.3 治疗血小板减少症的药物325

2.8.4 血容量扩充剂326

2.9 呼吸系统药物328

2.9.1 平喘药物328

2.9.2 镇咳药物334

2.9.3 祛痰药物336

2.10 泌尿生殖系统药物339

2.10.1 抗肾小球肾炎药物339

2.10.2 促进尿道结石排出药物341

2.10.3 治疗男性勃起功能障碍药物344

2.10.4 治疗良性前列腺增生药物347

2.10.5 作用于子宫平滑肌药物348

2.11 抗放射病药物352

参考文献356

第3章 新药非临床安全性评价方法366

3.1 一般药理学研究367

3.1.1 目的和意义367

3.1.2 实验材料和分组给药367

3.1.3 中枢神经系统研究368

3.1.4 心血管系统研究372

3.1.5 呼吸系统研究373

3.1.6 追加或补充的安全药理学研究373

3.2 单次给药毒性试验374

3.2.1 目的和意义374

3.2.2 主要内容和要求376

3.2.3 急性毒性试验常用方法379

3.3 重复给药毒性试验382

3.3.1 目的和意义382

3.3.2 主要内容和要求383

3.3.3 注意问题386

3.4 遗传毒性试验392

3.4.1 鼠伤寒沙门菌诱变试验（Ames试验）392

3.4.2 体外培养哺乳动物细胞染色体突变试验396

3.4.3 小鼠的骨髓微核试验397

3.5 生殖毒性试验401

3.5.1 一般生殖毒性试验401

3.5.2 致畸敏感期毒性试验403

3.5.3 围产期毒性试验405

3.6 致癌试验407

3.6.1 致癌试验的必要性407

3.6.2 致癌试验原则409

3.6.3 致癌试验的剂量选择410

3.6.4 哺乳动物培养细胞恶性转化试验413

3.6.5 动物短期致癌试验414

3.6.6 动物长期致癌试验414

3.6.7 生物技术药物致癌试验416

3.7 毒代动力学在药物长期毒性评价中的应用417

3.7.1 毒代动力学研究的基本考虑和方法419

3.7.2 长期毒性评价中药物暴露评价的其他方面420

3.8 免疫毒性试验420

3.8.1 基本原则421

3.8.2 常规毒性试验中免疫毒性相关指标422

3.8.3 额外的免疫毒性试验423

3.8.4 免疫原性、自身免疫和免疫刺激425

3.9 局部刺激性试验426

3.9.1 皮肤刺激性试验426

3.9.2 注射给药部位刺激性试验428

3.9.3 直肠刺激性试验430

3.9.4 阴道刺激性试验430

3.9.5 滴鼻剂和吸入剂刺激性试验431

3.9.6 口腔用药或滴耳剂刺激性试验432

3.9.7 眼刺激性试验433

3.9.8 溶血性试验434

3.10 过敏性试验436

3.10.1 主动皮肤过敏试验437

3.10.2 豚鼠最大化试验和Buehler试验439

3.10.3 齿齿类局部淋巴结试验440

3.10.4 被动皮肤过敏试验442

3.10.5 全身主动过敏试验443

3.10.6 皮肤光毒性试验444

3.10.7 皮肤光过敏反应试验446

3.10.8 过敏性试验的注意事项448

3.11 药物依赖性的动物试验449

3.11.1 阿片类药物的身体依赖性试验方法450

3.11.2 镇静催眠药和抗焦虑药的身体依赖性试验方法456

3.11.3 评价药物精神依赖性的试验方法458

参考文献464

第4章 非临床药代动力学试验方法466

4.1 非临床药代动力学试验设计467

4.1.1 总体要求467

4.1.2 研究项目468

4.1.3 数据处理与分析470

4.1.4 结果与评价470

4.1.5 问题与处理思路471

4.2 分析方法的建立与确证472

4.2.1 方法学确证的定义和分类473

4.2.2 对参照标准品的要求474

4.2.3 化学分析方法的形成474

4.2.4 方法学确证的建议476

4.2.5 免疫分析方法和微生物分析方法的形成477

4.2.6 确证后的方法在药物分析中的应用478

4.2.7 档案管理和方法学结果总结480

4.2.8 术语481

4.2.9 生物分析方法确证实例482

4.3 化学药物非临床药代动力学实验方法491

4.3.1 单次给药的药代动力学研究491

4.3.2 多次给药的药代动力学研究496

4.3.3 口服药物的吸收和生物利用度研究498

4.3.4 给药后药物在体内的组织分布研究500

4.3.5 药物在体内的粪、尿、胆汁排泄研究505

4.3.6 生物转化研究509

4.3.7 对药物代谢酶活性的影响研究533

4.4 生物技术药物药代动力学研究方法537

4.4.1 概论537

4.4.2 常用分析方法544

参考文献556

第5章 新药临床前评价的试验设计与统计分析559

5.1 试验设计概述559

5.1.1 试验设计的意义559

5.1.2 试验设计的原理560

5.1.3 试验设计三要素561

5.1.4 试验设计四原则561

5.1.5 试验设计类型562

5.2 假设检验中样本大小的估计563

5.2.1 样本大小估计所需要的前提条件563

5.2.2 采用定量资料的单组设计、配对设计或交叉设计时样本大小的估计564

5.2.3 采用成组设计时所需的样本含量565

5.2.4 多个样本均数的比较或完全随机区组设计时所需样本含量566

5.2.5 两总体概率比较时所需的样本含量567

5.2.6 多个样本频率比较时所需样本含量568

5.3 常见的试验设计类型及相应资料的统计分析568

5.3.1 正态分布的概念与正态性检验568

5.3.2 方差齐性的概念与方差齐性检验570

5.3.3 单组设计和配对设计及相应资料的统计分析570

5.3.4 成组设计及相应资料的统计分析572

5.3.5 单因素多水平设计及相应资料的统计分析574

5.3.6 优效性、等效性和非劣效性检验576

5.4 较复杂的试验设计简介579

5.4.1 配伍组设计579

5.4.2 拉丁方设计580

5.4.3 交叉设计581

5.4.4 析因设计583

5.4.5 重复测量设计583

5.4.6 正交设计584

5.4.7 均匀设计585

5.5 常见的定性资料的表达格式与统计分析586

5.5.1 横断面研究设计的2×2表资料及其统计分析586

5.5.2 队列研究设计的2×2表资料及其统计分析588

5.5.3 病例-对照研究设计的2×2表资料及其统计分析588

5.5.4 配对研究设计的2×2表资料及其统计分析589

5.5.5 双向无序R×C表资料及其统计分析590

5.5.6 结果变量为有序变量的单向有序R×C表资料及其统计分析591

5.5.7 双向有序且属性不同的R×C表资料及其统计分析593

5.5.8 双向有序且属性相同的R×C表资料及其统计分析594

5.6 按直线规律研究两变量之间的相互关系与依赖关系595

5.6.1 直线相关与回归分析的基本概念595

5.6.2 直线相关与回归的正确步骤595

5.6.3 直线相关与回归分析常见错误595

5.6.4 直线相关与回归分析计算公式及假设检验596

5.6.5 直线相关与回归分析的区间估计问题——利用回归方程进行预报和控制598

5.6.6 直线相关与回归分析应用实例599

5.6.7 用概率法求半数有效量600

5.7 按曲线规律研究两变量之间的依赖关系602

5.7.1 曲线回归分析的基本概念602

5.7.2 曲线回归分析的正确步骤604

5.7.3 曲线回归分析应用实例605

5.7.4 曲线回归分析应用中的常见错误607

5.8 单因素K水平（K≥2）设计生存时间数据统计分析609

5.8.1 生存时间数据特点及统计描述609

5.8.2 由生存时间数据计算所得的多个生存率的假设检验611

5.8.3 由生存时间数据描述的生存曲线的比较612

5.9 药效学和毒理学的试验设计与统计分析614

5.9.1 常见的试验设计模式与存在的问题614

5.9.2 定量资料的数据结构与统计分析方法的合理选择620

5.9.3 析因设计定量资料统计分析方法及实例621

5.9.4 重复测量设计定量资料统计分析方法及实例622

参考文献623

第6章 新药筛选方法学625

6.1 样品库的建立626

6.1.1 筛选样品的要求626

6.1.2 天然产物628

6.1.3 提取物633

6.1.4 组合生物催化637

6.1.5 合成化合物641

6.2 高通量细胞筛选模型651

6.2.1 基于STAT3/5信号通路的药物筛选模型651

6.2.2 基于HIV Tat基因转录调控通路的药物筛选模型654

6.2.3 基于X蛋白反式激活的抗HBV药物筛选模型655

6.2.4 基于干扰素α信号通路的抗病毒药物筛选模型657

6.2.5 基于PPARγ信号通路的药物筛选模型659

6.2.6 基于雌激素受体β亚型信号通路的药物筛选模型662

6.2.7 基于NF-kB信号通路的药物筛选模型664

6.3 高通量筛选667

6.3.1 高通量药物筛选常用仪器667

6.3.2 筛选操作668

6.3.3 数据存储和处理669

参考文献669

第7章 新药发现过程中吸收、代谢、分布和毒性的研究674

7.1 吸收的体外和原位模型675

7.1.1 吸收的体外模型675

7.1.2 在体单次灌流方法研究药物在肠道的吸收678

7.2 分布的体外模型680

7.2.1 药物与血浆蛋白结合实验680

7.2.2 血脑屏障模型682

7.3 代谢的体外模型684

7.3.1 代谢稳定性研究684

7.3.2 代谢酶的确定686

7.3.3 代谢酶抑制的测定687

7.3.4 肠道菌群对药物的代谢转化研究690

7.4 早期发现毒理学研究691

7.4.1 预测模型691

7.4.2 体外高通量毒性筛选692

7.4.3 活性代谢产物的检测695

7.4.4 高内涵筛选技术695

7.4.5 动物试验696

参考文献696

附录 正常实验动物和模型动物各项指标参考值698

表1 实验动物安全采血量698

表2 外周血血细胞指标（一）698

表3 外周血红细胞及血小板计数指标（二）699

表4 外周血白细胞及其分类计数（三）700

表5 外周血白细胞指标（四）701

表6 血清生化指标（一）701

表7 血清生化指标（二）702

表8 血清生化指标（三）702

表9 心电图指标702

表10 凝血和纤溶系统指标703

表11 常见动物骨髓象703

表12 实验动物脏器重量704

表13 实验动物体温和血液温度704

表14 实验动物临床生理指标705

表15 实验动物饲料量、饮水量、产热量705

表16 实验动物排便排尿量706

表17 实验动物生殖生理指标706

表18 实验动物蛋白指标707

表19 实验动物肠道长度708

表20 雌性NOD/Lt小鼠不同周龄血糖变化708

表21 kk小鼠携带AY基因饲喂高脂饲料后不同性别动物的血糖变化710

表22 kk小鼠携带AY基因饲喂繁殖饲料不同性别动物的血糖变化710

表23 kk小鼠未携带AY基因饲喂高脂饲料不同性别动物的血糖变化711

表24 kk小鼠未携带AY基因饲喂繁殖饲料不同性别动物的血糖变化711

表25 不同年龄nu/nu、nu／＋小鼠脾脏中含免疫球蛋白的细胞（C-Ig）分布712

表26 间接免疫荧光测定不同淋巴组织浆细胞中类型分布712

表27 SCID小鼠相关数据713

表28 自发性高血压（SHR）大鼠与WKY大鼠血流动力学参数713

表29 年轻自发性高血压（SHR）大鼠（12周龄）生化检验参数（一）713

表30 年老自发性高血压（SHR）大鼠（22周龄）生化检验参数（二）714

表31 年轻易卒中型自发性高血压（SHRsp）大鼠（12周龄）生化检验参数（三）715

表32 年老易卒中型自发性高血压（SHRsp）大鼠（22周龄）生化检验参数（四）716

表33 年轻WKY大鼠（12周龄）生化检验参数（五）717

表34 年老WKY大鼠（22周龄）生化检验参数（六）718

缩略词对照表719