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1绪论1

1.1 糖基转移酶简介1

1.2 糖基转移酶功能1

1.2.1 植物防御反应1

1.2.2 植物次生代谢产物修饰2

1.2.3 植物次生细胞壁合成2

1.2.4 植物激素平衡2

1.3 糖基转移酶14研究进展3

1.3.1 GT14/DUF266 （GT14-like）蛋白的鉴定3

1.3.2 GT14和GT14-like基因系统发育的关系4

1.3.3 GT14和GT14-like基因的进化4

1.3.4 GT14和GT14-like基因的表达模式分析4

1.3.5 GT14蛋白质三维结构及亚细胞定位9

1.4 植物启动子研究11

1.4.1 启动子结构及功能11

1.4.2 启动子克隆方法11

1.4.3 启动子的应用12

1.5 转录因子研究12

1.5.1 转录因子简介12

1.5.2 转录因子分类及功能12

1.6 转录因子与启动子互作研究方法13

1.6.1 酵母单杂交13

1.6.2 免疫共沉淀14

1.7 植物DNA甲基化的作用方式及功能14

1.7.1 植物DNA甲基化的作用方式14

1.7.2 植物DNA甲基化的功能15

1.8 木本植物不同发育阶段DNA甲基化水平和模式的变化16

1.8.1 DNA甲基化与木本植物的年龄17

1.8.2 DNA甲基化与木本植物的花期、休眠和育性18

1.9 木本植物离体繁殖过程中的DNA甲基化模式重建18

1.9.1 组织培养植株与野生植株的DNA甲基化水平和模式差异19

1.9.2 再生过程、体胚发生、继代培养及外植体状态与DNA甲基化20

1.10 植物DNA甲基转移酶及与甲基化有关的蛋白质21

1.10.1 METI家族21

1.10.2 CMT家族21

1.10.3 DRM家族22

1.11 白桦的生物学特性23

1.12 研究意义23

2白桦BpGT14基因及其启动子的克隆及生物信息学分析25

2.1 实验材料25

2.1.1 植物材料25

2.1.2 菌株及载体25

2.1.3 数据分析26

2.2 实验方法26

2.2.1 白桦BpGT14基因生物信息学分析26

2.2.2 白桦茎段悬浮细胞非生物胁迫处理26

2.2.3 转录表达定量分析27

2.2.4 数据处理27

2.2.5 白桦BpGT14启动子的克隆27

2.2.6 启动子生物信息学分析30

2.2.7 植物表达载体的构建30

2.2.8 植物表达载体农杆菌的转化32

2.2.9 BpGT14启动子在烟草中的表达活性33

2.2.10 启动子在白桦细胞中的表达活性33

2.3 结果与分析34

2.3.1 白桦BpGT14基因的生物信息学分析34

2.3.2 白桦BpGT14基因时空特异性表达分析37

2.3.3 白桦茎段悬浮细胞BpGT14基因非生物胁迫下表达分析38

2.3.4 白桦BpGT14基因启动子克隆39

2.3.5 白桦BpGT14基因启动子序列元件分析40

2.3.6 启动子pXGUS-P及pXGFP-P植物表达载体的构建及鉴定41

2.3.7 植物表达载体转化农杆菌的鉴定42

2.3.8 非生物胁迫下启动子在烟草中的表达活性42

2.3.9 启动子在白桦细胞中的表达活性43

2.4 讨论45

2.5 本章小结49

3酵母单杂交筛选启动子区及MYBPLANT元件结合候选蛋白51

3.1 实验材料51

3.2 实验方法51

3.2.1 启动子1156bp片段PCR扩增51

3.2.2 诱饵载体pAbAi线性化及与启动子片段的连接51

3.2.3 MYBPLANT元件的构建52

3.2.4 酵母感受态的制备53

3.2.5 重组诱饵载体pAbAi转化酵母感受态细胞53

3.2.6 诱饵酵母的鉴定54

3.2.7 报告基因在诱饵酵母中本底表达水平的测定54

3.2.8 白桦文库cDNA的合成55

3.2.9 酵母单杂交文库的构建及筛选57

3.2.10 阳性克隆菌株的鉴定58

3.2.11 阳性克隆cDNA插入片段的生物信息学分析58

3.2.12 启动子候选互作蛋白BpARF2基因的非生物胁迫响应59

3.3 结果与分析59

3.3.1 重组诱饵载体的构建59

3.3.2 重组诱饵质粒转化酵母感受态细胞59

3.3.3 报告基因在诱饵酵母中本底表达水平的测定59

3.3.4 白桦文库cDNA的合成60

3.3.5 酵母单杂交文库的构建及筛选61

3.3.6 阳性克隆cDNA插入片段的生物信息学分析61

3.3.7 启动子互作候选蛋白BpARF2基因非生物胁迫响应64

3.3.8 MYB-pAbAi重组诱饵载体的构建67

3.3.9 MYBPLANT元件结合候选蛋白的筛选68

3.4 讨论68

3.5 本章小结70

4启动子MYBPLANT元件结合候选蛋白的鉴定72

4.1 实验材料72

4.2 实验方法72

4.2.1 候选蛋白互作强弱初步鉴定72

4.2.2 白桦BpAL4基因的克隆72

4.2.3 白桦BpAL4基因生物信息学分析74

4.2.4 候选蛋白互作强弱初步鉴定74

4.2.5 三次重复元件pCXGUS植物表达载体构建76

4.2.6 三亲杂交及农杆菌的遗传转化77

4.2.7 烟草中GUS基因表达水平鉴定78

4.2.8 非生物胁迫下白桦BpAL4基因表达水平鉴定78

4.3 结果与分析78

4.3.1 候选蛋白互作强弱鉴定78

4.3.2 白桦BpAL4基因的克隆79

4.3.3 白桦BpAL4基因生物信息学分析79

4.3.4 白桦BpAL4基因植物表达载体的构建82

4.3.5 三次重复元件pCXGUS植物表达载体构建83

4.3.6 BpAL4蛋白及MYBPLANT元件共转化分析84

4.4 讨论85

4.5 本章小结87

5白桦BpGT14基因表达载体及RNA干扰载体的构建及遗传转化88

5.1 实验材料88

5.2 实验方法88

5.2.1 白桦总RNA的提取与cDNA的合成88

5.2.2 白桦BpGT14基因pMD 18-T载体的构建88

5.2.3 白桦BpGT14基因干扰载体的构建89

5.2.4 三亲杂交法转化根癌农杆菌89

5.2.5 根癌农杆菌介导的白桦遗传转化90

5.2.6 转基因植株的分子鉴定91

5.2.7 转基因白桦组培苗的移栽92

5.2.8 石蜡切片92

5.2.9 转基因白桦木质素、纤维素、半纤维素和果胶的测定93

5.3 结果与分析96

5.3.1 白桦BpGT14基因pMD 18-T载体的构建96

5.3.2 白桦BpGT14基因干扰载体的构建97

5.3.3 三亲杂交97

5.3.4 转基因植株的获得98

5.3.5 转基因植株的分子鉴定98

5.3.6 RNAi白桦茎段结构分析99

5.3.7 BpGT14-RNAi转基因白桦细胞壁成分分析101

5.4 讨论103

5.5 本章小结106

6白桦微繁过程中BpGT14表达及DNA甲基化的变异机制108

6.1 实验材料108

6.1.1 植物材料108

6.1.2 实验器材108

6.2 实验方法108

6.2.1 培养基及培养条件108

6.2.2 外植体选取与消毒109

6.2.3 腋芽增殖的继代培养109

6.2.4 愈伤组织的诱导及分化109

6.2.5 再生植株生根及移栽109

6.2.6 酶液制取109

6.2.7 保护酶活性的测定109

6.2.8 木质素测定111

6.2.9 丙二醛含量测定111

6.2.10 可溶性糖含量测定111

6.2.11 可溶性蛋白含量测定112

6.2.12 白桦DNA提取及亚硫酸盐处理112

6.2.13 BpGT14及甲基转移酶基因表达量分析113

6.2.14 数据处理115

6.3 结果与分析115

6.3.1 愈伤组织的诱导和分化115

6.3.2 甲基转移酶基因的表达115

6.3.3 甲基转移酶的活性分析116

6.3.4 5′-CCGG的胞嘧啶甲基化水平118

6.3.5 再生不同阶段细胞氧化还原水平120

6.3.6 再生不同阶段变异的主成分分析120

6.3.7 愈伤再生不同发育阶段BpGT14基因表达分析124

6.3.8 白桦BpGT14基因内含子生物信息学分析124

6.3.9 愈伤再生不同发育阶段BpGT14基因启动子及编码区DNA甲基化变异128

6.4 讨论131

6.4.1 甲基转移酶基因在再生过程中的表达131

6.4.2 白桦组织培养中DNA甲基化的变化131

6.4.3 微繁殖过程中的生理变化132

6.4.4 不同发育阶段的表观遗传参数和生理指标的变化133

6.4.5 愈伤再生不同发育阶段BpGT14基因启动子及编码区DNA甲基化变异133

6.5 本章小结134

7展望136

参考文献137