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前言1

第1章 绪论1

1．1．1茨维特经典液相色谱实验2

1．1．2现代高效液相色谱分析系统3

1．1．3高效液相色谱与经典液相（柱）色谱法的比较4

1．1．4高效液相色谱与气相色谱的比较5

1．2．1高效液相色谱按两相分离过程的物理化学原理分类7

1．2．2高效液相色谱按溶质在色谱柱洗脱的动力学过程分类10

1．3．1高效液相色谱法的应用范围11

1．3．2高效液相色谱法使用的局限性12

第2章 高效液相色谱仪简介13

2．1．1高效液相色谱仪组成示意图14

2．1．2流动相的储液罐15

2．1．3流动相的过滤器16

2．1．4流动相的减压过滤和抽真空脱气17

2．1．5流动相的吹氦脱气18

2．1．6流动相的加热回流脱气19

2．1．7流动相的超声波脱气19

2．1．8流动相的在线真空脱气20

2．2．1高压输液泵的分类21

2．2．2注射式柱塞恒流泵22

2．2．3 Perkin-Elmer 200系列高精度注射式柱塞恒流泵23

2．2．4单柱塞往复式恒流泵25

2．2．5隔膜式单柱塞往复恒流泵26

2．2．6往复式柱塞泵中偏心凸轮的设计、柱塞剖面和单向阀结构27

2．2．7压力传感器的结构28

2．2．8双柱塞往复式并联泵29

2．2．9 Waters 1500系列双柱塞往复式并联泵的机械传动机构30

2．2．10日立L-7100型双柱塞往复式串联泵的机械传动结构30

2．2．11双柱塞往复式串联泵31

2．2．12依利特P 230型双柱塞往复式串联泵的机械传动结构和泵头组装结构32

2．2．13双柱塞往复式并联泵和串联泵的结构比较33

2．2．14双柱塞各自独立驱动的往复式串联泵34

2．2．15 Alliance 2690分离单元主柱塞和蓄积柱塞相对运动矢量图35

2．2．16恒压泵（气动放大泵）36

2．2．17低压梯度（外梯度）37

2．2．18 HP 1100四元低压梯度系统38

2．2．19高压梯度（内梯度）39

2．2．20 HP 1100二元高压梯度系统40

2．3．1管道过滤器40

2．3．2脉动阻尼器41

2．3．3反压调节阀42

2．3．4无限直径效应42

2．3．5停流进样装置43

2．3．6六通阀进样装置44

2．3．7 Rheodyne 7125型六通进样阀的结构45

2．3．8 Rheodyne 7410型和7520型六通进样阀46

2．3．9 Valco微量注射六通阀47

2．3．10自动进样器48

2．4．1色谱柱材料及规格49

2．4．2保护柱50

2．4．3色谱柱连接方式51

2．5．1检测器的分类和响应特性52

2．5．2检测器的性能指标53

2．5．3基线的噪声、漂移；检测器的线性范围、灵敏度、敏感度的测量54

2．5．4固定波长紫外吸收检测器55

2．5．5可变波长紫外吸收检测器56

2．5．6紫外吸收检测器的光源特性57

2．5．7单通道UVD流通池的结构58

2．5．8光二极管阵列检测器59

2．5．9折射率检测器60

2．5．10蒸发光散射检测器的工作原理61

2．5．11 ELSD直通式漂移管中的撞击器62

2．5．12 ELSD流动相雾化和蒸发过程63

2．5．13 ELSD检测过程64

2．5．14荧光检测器65

2．5．15 FLD的检测池结构66

2．5．16电导检测器67

2．5．17电雾式检测器68

2．5．18多角度激光光散射检测器69

2．6．1微处理机70

2．6．2色谱工作站71

2．6．3 HPLC仪器简介72

第3章 固定相75

3．1．1高效液相色谱常用的固定相76

3．1．2表征固定相性质的重要参数77

3．1．3固定相的粒径与标准筛的目数关系78

3．1．4全多孔、薄壳、非多孔硅胶（或Al2 O3）固定相的外观、形态79

3．1．5全多孔固定相的内部结构80

3．2．1液固吸附色谱的基本原理81

3．2．2液固吸附色谱固定相的分类及溶质的保留特性82

3．2．3全多孔硅胶表面硅羟基的结构83

3．2．4硅胶含有的金属杂质及对色谱行为的影响84

3．2．5硅胶表面结构经热处理后的变化85

3．2．6流动相水含量对硅胶固定相分离的影响86

3．2．7非典型、具有特殊孔隙结构的硅胶87

3．2．8苯乙烯-二乙烯基苯高交联全多孔（非多孔）共聚物［P（S-DVB）］微球88

3．2．9流通粒子89

3．2．10聚合物包覆硅胶90

3．2．11石墨化炭黑的性能91

3．2．12石墨化炭黑的晶体结构92

3．2．13液固色谱法常用固定相的物理性质93

3．3．1液液分配色谱的基本原理95

3．3．2液液分配色谱使用的固定液96

3．4．1化学键合固定相的结构97

3．4．2化学键合固定相的制备97

3．4．3制备键合固定相进行的化学反应98

3．4．4化学键合固定相的类型及应用范围99

3．4．5正相键合相色谱法的分离原理100

3．4．6反相键合相色谱法的分离原理101

3．4．7硅胶表面残留硅羟基对化学键合相保留行为的影响102

3．4．8在正相键合相色谱中的氢键作用力103

3．4．9在反相键合相色谱中的疏水作用力104

3．4．10反相键合相色谱中流动相组成对分离选择性的调节105

3．4．11键合相的型号对色谱分离重现性的影响106

3．4．12新型单齿空间保护键合固定相107

3．4．13新型单齿水平聚合键合固定相108

3．4．14新型单齿高密度键合固定相109

3．4．15新型单齿立体保护键合固定相109

3．4．16新型单齿静电屏蔽键合固定相110

3．4．17新型双齿键合固定相111

3．4．18新型双齿多层键合固定相111

3．4．19新型多齿网络状多层键合固定相112

3．4．20新型高效键合固定相简介113

3．4．21评价反相固定相特性的Tanaka参数115

3．4．22用Tanaka参数评价常用反相色谱柱116

3．4．23评价反相固定相特性的平面六轴极坐标图示117

3．5．1整体色谱柱118

3．5．2聚合物凝胶整体柱119

3．5．3交互传导介质整体柱120

3．5．4硅胶凝胶整体柱121

3．5．5硅胶凝胶整体柱与硅胶微粒填充柱的渗透性能比较122

3．5．6整体柱与微粒填充柱、开管柱的柱性能比较123

3．6．1反相离子对色谱法基本原理124

3．6．2反相离子对色谱法的固定相和流动相125

3．6．3反相离子对色谱法分离强极性有机酸126

3．6．4正相离子对色谱法的固定相和流动相127

3．6．5离子对色谱法中，流动相的pH对分离选择性的影响128

3．6．6正相离子对色谱法分离生物胺129

3．6．7在离子对色谱法中，离子对试剂的性质和浓度的影响130

第4章 流动相131

4．1．1在高效液相色谱分析中，对作为流动相溶剂的要求132

4．1．2高效液相色谱法中选择流动相的一般方法133

4．1．3在高效液相色谱分析中，表征溶剂特性的重要参数134

4．1．4溶剂强度参数ε0135

4．1．5溶解度参数δ138

4．1．6极性参数P′139

4．1．7黏度η141

4．1．8二元混合溶剂流动相的表面张力γ和介电常数e142

4．1．9作为高效液相色谱法流动相的溶剂性质143

4．2．1溶剂的选择性分组145

4．2．2多元混合溶剂的多重选择性146

4．2．3在正相色谱中流动相的选择150

4．2．4在反相色谱中流动相的选择151

4．2．5反相色谱中具有等强度洗脱能力的二元混合溶剂的对应组成152

4．2．6流动相的极性与溶质的容量因子的关联153

4．3．1通过调节流动相的极性来改善色谱分离的选择性154

4．3．2反相色谱中，改变多元混合溶剂中强洗脱溶剂组成对分离选择性的影响155

4．3．3通过向流动相中加入改性剂来改善色谱分离的选择性156

4．3．4溶质的保留值随流动相溶剂极性变化的一般规律157

4．4．1绿色流动相——超热水158

4．4．2超热水流动相的获取方法159

4．4．3超热水作流动相，以UVD作检测器的高效液相色谱仪160

4．4．4超热水作流动相，以FID作检测器的高效液相色谱仪161

4．4．5以超热重水（D2 O）作流动相的高效液相色谱仪，并同时构成HPLC-NMR-MS联用体系162

第5章 梯度洗脱163

5．1．1等度洗脱和梯度洗脱164

5．1．2梯度洗脱的基本原理166

5．1．3梯度洗脱中平均容量因子？和梯度洗脱时间tG的计算167

5．2．1影响梯度洗脱的各种因素：梯度洗脱时间（tG）对分离的影响168

5．2．2梯度陡度对保留值的影响169

5．2．3强洗脱溶剂组分B浓度变化范围的影响171

5．2．4柱温变化对保留值的影响173

5．2．5梯度洗脱程序曲线形状的影响174

5．3．1梯度洗脱的实验条件：空白梯度175

5．3．2色谱柱中流动相的平衡176

5．3．3线性梯度洗脱的滞后现象177

5．4．1梯度洗脱的图示方法：二元溶剂梯度洗脱178

5．4．2三元溶剂梯度洗脱179

5．4．3四元溶剂梯度洗脱181

第6章 体积排阻色谱法184

6．1．1体积排阻色谱法原理185

6．1．2样品分子的分布系数和凝胶的渗透极限、排阻极限186

6．1．3体积排阻色谱法的特点187

6．2．1体积排阻色谱法固定相的分类188

6．2．2软质凝胶：葡聚糖189

6．2．3半刚性凝胶190

6．2．4刚性凝胶191

6．2．5新型体积排阻固定相194

6．2．6凝胶固定相的特性参数196

6．2．7凝胶色谱柱的制备197

6．2．8体积排阻色谱图的特点198

6．3．1体积排阻色谱法中对流动相的要求199

6．3．2凝胶渗透色谱使用的流动相200

6．3．3一些聚合物样品的折射率201

6．3．4凝胶过滤色谱使用的流动相202

6．4．1聚合物的平均相对分子质量203

6．4．2聚合物的相对分子质量分布204

6．4．3典型的凝胶渗透色谱图205

6．4．4凝胶渗透色谱柱标定曲线的制作206

6．4．5通用的校正方法——普适校正法207

6．4．6常见聚合物-溶剂体系中，Mark-Houwink方程中的K和α值209

第7章 离子（交换）色谱法211

7．1．1离子交换色谱分离原理212

7．1．2离子交换色谱的选择性系数和容量因子213

7．2．1苯乙烯-二乙烯基苯共聚物为基体的阳、阴离子交换树脂的制备214

7．2．2常用离子交换树脂的性质215

7．2．3离子交换树脂的结构形态216

7．3．1抑制器的工作原理217

7．3．2树脂填充抑制器218

7．3．3管状空心纤维抑制器220

7．3．4平板微膜抑制器221

7．3．5自动再生连续工作的抑制器223

7．4．1离子（交换）色谱的流动相组成224

7．4．2在线淋洗液发生器225

7．5．1直流安培检测器226

7．5．2脉冲安培检测器229

7．5．3积分安培检测器230

7．6．1用在线淋洗液发生器分析多种阴离子混合物231

7．6．2体液中儿茶酚胺的测定232

7．6．3基于脉冲安培检测的糖类分析方法233

7．6．4基于积分安培检测的氨基酸分析方法234

第8章 亲和色谱法235

8．1．1亲和色谱法的分离原理：锁匙结构络合物的生成236

8．1．2亲和色谱法的分类238

8．2．1亲和色谱法固定相对基体材料的要求及基体材料的分类239

8．2．2葡聚糖240

8．2．3琼脂糖242

8．2．4聚丙烯酰胺及其衍生物244

8．2．5甲基丙烯酸酯共聚物凝胶247

8．2．6脲醛树脂248

8．2．7多糖聚合物基体的活化249

8．2．8合成高聚物基体的活化250

8．2．9无机载体材料的活化251

8．3．1间隔臂在亲和固定相中的作用252

8．3．2间隔臂长度的选择253

8．3．3疏水性间隔臂254

8．3．4亲水性间隔臂255

8．4．1亲和色谱的配位体分类256

8．4．2生物特效配位体257

8．4．3染料配位体258

8．4．4定位金属离子配位体259

8．4．5包合配合物配位体260

8．5．1亲和色谱流动相的组成261

8．5．2非选择性洗脱法（一）：改变流动相的pH262

8．5．3非选择性洗脱法（二）：改变流动相的离子强度263

8．5．4非选择性洗脱法（三）：改变流动性的极性264

8．5．5非选择性洗脱法（四）：加入离液序列试剂265

8．5．6特效性洗脱法266

8．5．7特殊洗脱方法267

第9章 高效液相色谱法的基本理论268

9．1．1色谱分离过程的基本关系式（一）：溶质的保留值269

9．1．2色谱分离过程的基本关系式（二）：色谱柱的柱效270

9．1．3色谱分离过程的基本关系式（三）：相邻组分的分离度271

9．2．1表征液相色谱柱填充性能的重要参数（一）：总孔率272

9．2．2表征液相色谱柱填充性能的重要参数（二）：柱压力降273

9．2．3表征液相色谱柱填充性能的重要参数（三）：柱渗透率274

9．3．1高效液相色谱的速率理论：液体和气体流动相性质的差别275

9．3．2影响溶质在液相色谱柱中运行的各种因素276

9．3．3引起溶质色谱峰形扩展的因素（一）：涡流扩散项277

9．3．4引起溶质色谱峰形扩展的因素（二）：分子扩散项278

9．3．5引起溶质色谱峰形扩展的因素（三）：固定相的传质阻力项279

9．3．6引起溶质色谱峰形扩展的因素（四）：移动流动相的传质阻力项280

9．3．7引起溶质色谱峰形扩展的因素（五）：滞留流动相的传质阻力项281

9．3．8速率理论：范第姆特方程式的表达及图示282

9．3．9高效液相色谱和气相色谱范第姆特曲线的比较283

9．4．1描述色谱柱性能的折合参数284

9．4．2诺克斯方程式285

9．4．3使用不同粒度固定相色谱柱的h-v曲线的比较286

9．5．1色谱柱的三个重要操作参数287

9．5．2实用柱操作参数的优化288

9．5．3保持色谱柱柱效不变前提下，色谱分析参数的相关性289

9．5．4色谱柱操作参数优化的图示法290

9．5．5在不同黏度流动相中，色谱柱操作参数的优化图示法292

9．6．1 HPLC中的“无限直径”效应294

9．6．2 HPLC的柱外效应295

9．7．1超高效液相色谱技术296

9．7．2超高效液相色谱的理论基础297

9．7．3 ACQUITY UPLCTMC18色谱柱298

9．7．4超高效液相色谱的输液系统300

9．7．5超高效液相色谱的高速检测器302

9．7．6低扩散、低交叉污染的自动进样器303

9．7．7超高效液相色谱的应用305

9．7．8 UPLC中使用亚2 μm反相固定相的色谱分离特性307

9．7．9 UPLC与HPLC的比较和超高效液相色谱仪的研制现状308

第10章 建立高效液相色谱分析方法的一般步骤和实验技术310

10．1．1建立HPLC分析方法的一般步骤311

10．1．2分离模式选择的依据（一）：样品的溶解度312

10．1．3分离模式选择的依据（二）：样品的相对分子质量范围313

10．1．4分离模式选择的依据（三）：样品的分子结构和分析特性314

10．1．5根据样品的溶解性质来选择HPLC分离方法319

10．1．6根据样品的相对分子质量来选择HPLC分离方法320

10．2．1分离操作条件的选择：容量因子k′和死时间tM的测量322

10．2．2色谱柱操作参数的选择323

10．2．3样品组分保留值和容量因子的选择324

10．2．4相邻组分的选择性系数和分离度的选择325

10．3．1 HPLC的实验技术（一）：溶剂的纯化技术327

10．3．2 HPLC的实验技术（二）：HPLC色谱柱的装填方法：干法填充和湿法填充328

10．3．3 HPLC的实验技术（三）：梯度洗脱技术333

10．3．4 HPLC的实验技术（四）：色谱柱前和柱后的衍生化技术334

第11章 高效液相色谱法的分析应用335

11．1．1在生物化学和生物工程中的应用336

11．1．2氨基酸分析中使用的柱前衍生化试剂及高效液相色谱分析337

11．1．3氨基酸和小肽的液相色谱分离342

11．1．4蛋白质的高效液相色谱分离345

11．1．5核碱和核苷的紫外吸收曲线及高效液相色谱分析351

11．1．6核碱、核苷和核苷酸组成的对应关系与它们的高效液相色谱分析354

11．1．7寡聚核苷酸、核酸及其碎片与它们的高效液相色谱分析360

11．1．8生物碱的高效液相色谱分析365

11．2．1在医药研究中的应用367

11．2．2解热镇痛药APC的成分分析368

11．2．3镇静药巴比妥类药物分析369

11．2．4安定药物的成分分析370

11．2．5心血管药物的分析371

11．2．6磺胺类消炎药的成分分析372

11．2．7甾类药物的分析373

11．2．8肾上腺皮质激素的分析374

11．2．9抗生素分析375

11．2．10头孢菌素混合物的分析376

11．2．11硫酸庆大霉素有效成分分析377

11．2．12四环素的分离378

11．2．13生物碱类药物分析379

11．2．14麻醉药物的分析380

11．2．15手性药物心得安对映体的分离381

11．2．16中药人参中有效成分分析382

11．2．17中药银杏提取液中有效成分分析383

11．3．1在食品分析中的应用384

11．3．2单糖在胺基键合相上的分离385

11．3．3有机酸及酸味剂的分离388

11．3．4水溶性维生素的分析391

11．3．5油溶性维生素的分析393

11．3．6食品中防腐剂的分析396

11．3．7食品中抗氧化剂的分析399

11．3．8软饮料中糖精和甜味素的分析402

11．3．9食用香料的分析404

11．3．10在反相键合相上，人工合成色素的分析406

11．3．11在多孔石墨碳反相柱，用ELSD分析矿泉水中痕量无机离子411

11．3．12食品污染物的分析412

11．4．1在环境污染分析中的应用415

11．4．2多环芳烃的紫外吸收波长和荧光的激发和发射波长以及它们的高效液相色谱分析415

11．4．3在硅胶正相吸附色谱柱上多氯联苯的分离419

11．4．4在正相分配色谱柱上有机氯农药的分离421

11．4．5在反相键合相上有机磷农药的分离422

11．4．6在反相键合相上氨基甲酸酯类农药的分离423

11．4．7在反相键合相上苯酚及其衍生物的分离424

11．4．8在反相键合相上脂肪胺的分离425

11．5．1在精细化工分析中的应用427

11．5．2在正相分配固定相上芳基取代醇和多元醇的分析427

11．5．3在反相键合相上芳香醇、醛、酮的分析428

11．5．4在硅胶正相吸附色谱柱上肉豆蒄醚和芳香醚的分析429

11．5．5在非极性色谱柱上脂肪酸的分析430

11．5．6在反相键合相上芳香酸酯的分析431

11．5．7在键合固定相上表面活性剂的分析433

11．5．8用凝胶渗透色谱柱分析聚合物标样436

11．5．9用高效阴离子交换柱（HPAE）和脉冲安培检测器（PAD）分析天然产物聚合物437

参考文献440

参考书目444

附录一 高效液相色谱仪的故障排除与维护445

附录二 色谱柱的平衡、保护与清洗、再生技术452

附录三 高效液相色谱的固定相458